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病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomicsnextgenerationsequencing，mNGS,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体，具有无偏倚性、广覆盖、快速等优点。
随着第二代测序病原检测技术不断普及，感染性疾病的病原学精准诊断逐渐变成可能。年11月15日，《中华传染病杂志》发布了由医院感染科牵头、来自全国18家单位的22位专家参与讨论和撰写的《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》。该共识涉及所有感染性疾病，建立了中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范，意义重大。
本专家共识就二代测序的(1)临床应用范围(2)样本采集(3)分析解读和(4)诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。
01
证据强度和证据质量的分级定义
证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。
证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。
02
二代测序的临床需求与应用范围
(一)背景及概述
推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。
推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。
二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA或RNA即可。从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6h至7d不等(平均48h)。
二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。另外，二代测序也被报道可用于“排除”检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测，但这些应用通常需要极高的覆盖深度。
(二)二代测序的适用范围
1.二代测序在临床疑似中枢神经系统感染中的适用范围
推荐意见3：对于怀疑中枢神经系统急性感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16～20℃冰箱。在完成常规生物化学检查和培养之后，若3d内未获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本(A，I)。
推荐意见4：对于疑似中枢神经系统病毒感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16～20℃冰箱。在传统PCR分子检测(包括多重探针分子PCR方法)后若未能获得明确的病原学依据，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本(A，Ⅱ)。
推荐意见5：对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测(A，Ⅱ)。
中枢神经系统感染的临床表现和实验室检查包括以下一种或多种：发热(体温38℃)、头痛、脑膜刺激征、呕吐、抽搐、局灶性神经功能障碍、意识改变或嗜睡、脑脊液中白细胞数量增加、脑脊液中蛋白质水平升高和(或)葡萄糖水平降低、脑成像显示感染的改变。
目前，在常见病原体之外，二代测序在中枢神经系统感染中已成功检测到多种新发及少见病原体，如羊布鲁菌、星状病毒、热带假丝酵母、狒狒巴拉姆希阿米巴等。
对于慢性中枢神经系统感染的患者，二代测序检测罕见、少见病原体的能力可显著提高患者病原学确诊的概率。对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测。
对于急性中枢神经系统感染的患者，在完成常规生物化学检查和培养之后，若仍未获得明确的病原学依据，建议将二代测序作为二线首选检测手段。
对于疑似中枢神经系统病毒感染的患者，在传统PCR检测后若未能获得明确的病原学依据，建议将二代测序作为二线首选检测手段。
2.二代测序在临床疑似血流感染中的适用范围
推荐意见6：对于怀疑血流感染的患者，如有条件，推荐在抽取血培养标本时同步留取2mL血标本，分离血浆后保存于-16～20℃冰箱，血培养3d未报阳且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存血标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本(A，Ⅱ)。
推荐意见7：对于怀疑继发性血流感染的患者，在原发感染灶的病原学检测为阴性或因各种因素无法送检合适标本的情况下，可考虑将血标本的二代测序检测作为二线检测方法(B，Ⅲ)。
血流感染包括各种病原微生物(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等)入侵血流所引起的感染。除单纯性血流感染外，血流感染还包括感染性心内膜炎、导管相关性血流感染等复杂性感染。血流感染可为原发性，亦可继发于局灶性感染。
血流感染的非选择性二代测序检测范围涵盖细菌、真菌、病毒(鼻病毒、腺病毒、CMV等)、不典型病原体(柯克斯体、巴尔通体等)。由于大部分血流感染的病原体[包括细菌、真菌、寄生虫(如疟原虫)、部分病毒(如疱疹病毒)]均以DNA作为遗传物质，所以推荐将DNA二代测序作为血流感染的首选检测方法，仅在不能排除RNA病毒感染(如肾综合征出血热、登革热、病毒性肺炎等)时推荐进行RNA测序。
目前，由于缺乏抗感染治疗对二代测序诊断性能影响的高等级研究，所以在血流感染中二代测序检测的最佳时间窗仍未确定。研究提示，二代测序在患者起病后1～2周的时间内仍可保持高于培养的阳性率，但其仍可随时间推移下降。此外，血培养与血二代测序存在优势互补的情况。
3.二代测序在临床疑似局灶性感染中的适用范围
推荐意见8：对于怀疑局灶性感染的患者，在对局灶部位完成常规的生物化学、培养或PCR检测后，若未能获取病原学诊断结果，推荐将二代测序作为二线首选检测手段(B，Ⅱ)。
局灶性感染是除血流感染、中枢神经系统感染、呼吸道感染外，以局部组织出现感染性症状如红、肿、热、痛、扪及波动感、有脓液渗出为表现的一类疾病。部分局灶性感染可通过辅助检查手段，如超声检查、影像学检查、侵袭性检查(内镜、穿刺等)，发现疑似感染性病灶(组织或积液)，伴或不伴炎症相关指标升高等。
目前，已有多项研究报道二代测序可提高皮肤软组织感染、骨关节感染、眼内感染、尿路感染、浆膜腔感染、其他组织感染中的病原学检测能力，二代测序在局灶性感染标本中的较高灵敏性可能与局灶性感染标本中的致病病原体相对载量较高有关。在组织感染方面，对创伤弧菌、非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌等均有较强的诊断价值。在眼部感染中，除了对常见的病毒、细菌、真菌性眼内炎有诊断价值以外，还对不常见的病原体如弓形虫、棘阿米巴、风疹病毒、隐球菌等感染有较强的提示作用。在尿路感染中，研究显示其可用于耐药细菌的检测。
4.二代测序在临床疑似呼吸道感染中的适用范围
推荐意见9：对于呼吸道感染患者，若3d内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐留取呼吸道标本进行二代测序检测(A，Ⅱ)。
推荐意见10：对于高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测，若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录(A，Ⅱ)。
根据二代测序原理，可对包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同时进行检测。可在24～72h内鉴定标本中可能存在的常规方法无法鉴定的罕见病原体、病毒等。并可对多重感染进行鉴定。
二代测序不能替代传统检测方法，而是应作为传统方法无法明确感染病原体时的补充。对于普通呼吸道感染，先完善传统方法的检测；若无法明确且患者病情迁延不愈时，可将二代测序作为首选检测手段。对于高度怀疑病毒性肺炎的患者，如在病毒高发季节急性起病、血白细胞计数正常或偏低、病情进展快，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测以及培养等；若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录。对于免疫抑制患者出现呼吸道感染或病情危重，在送检传统病原学检测方法的同时，应尽快行呼吸道标本(尽量靠近病灶)二代测序检测，以尽早明确罕见病原体或混合感染。
03
二代测序的流程与质量控制
推荐意见11：采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则(A，Ⅱ)。
推荐意见12：样本应直接从患者感染部位的体液或组织中进行采集(A，Ⅱ)。
推荐意见13：当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患者的血液标本送检(B，Ⅱ)。
推荐意见14：实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程(样本采集，样本前处理/核酸抽提及文库建立，质量控制及生物信息分析，二代测序结果的实验室判读)(A，Ⅲ)。
推荐意见15：每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×10∧7条(即20Ｍ特异性序列数)，此外建议测序序列读长不少于单端50bp(A，Ⅲ)。
推荐意见16：对数据进行分析时，建议采用临床应用级别的数据库，审慎使用公共数据库(A，Ⅲ)。
推荐意见17：建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量、序列读长，以及相关的质控参数(A，Ⅲ)。
(一)样本采集
针对患者感染部位的不同，采集的样本类型主要包括静脉血、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹水、组织、咽拭子、局灶穿刺物等多种类型。不同类型的样本采集需遵循以下原则：
①对于无菌体液，如静脉血、脑脊液、胸腔积液、腹水等，需按照严格的无菌操作采集样本，采集前对局部或周围皮肤进行消毒处理，消毒液需与皮肤作用一定时间，待皮肤干燥后再取样，一般收集第2管标本送检。采集的样本须置于无菌容器内。
②对于有菌部位的样本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，应标明样本采集部位，在样本采集过程中应尽量避免引入该部位的正常菌群，以免干扰后续检测结果。
采集的样本应尽量选取感染部位的体液或组织，可提高检测结果的可信度。若感染部位的样本采集难度较大，可选择外周血液标本，但有可能会降低检测结果的准确性。
所有采集的感染部位样本均应及时送检。标本远距离运输需采用冷链运输，并保证无菌原则。应严格遵守相应测序厂商的运输标准作业程序(standardoperationprocedure，SOP)，尽可能避免冻融环节。对于不能及时送检的样本，应按照前述各个标本的相应要求进行保存。
(二)样本前处理/核酸抽提及文库建立
不同样本类型均来源于疑似感染部位，具有潜在的感染性，在样本处理前需进行灭活处理。(1)对于痰液样本，由于本身黏性较高，为方便后续实验操作，灭活后还需进行液化处理(2)对于血液样本，需根据实际检测需求决定是否离心进行血浆分离(3)对于组织样本，为提高核酸提取效率，需预先将其切碎后进行操作。样本经过处理后都要进行核酸提取，核酸的质量是决定二代测序成功的关键。
(三)二代测序结果的实验室判读推荐
目前，不同的测序平台其二代测序病原体检测的判读阈值可能不同。
04
二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证
在某些临床场景中，二代测序不仅有助于进行快速、精准的诊断，而且也对制订抗感染治疗方案及后续疗效评估具有指导作用。
推荐意见18：二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证(B，Ⅲ)。
推荐意见19：对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根据推荐意见1至13采集合适的样本进行二代测序，根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断，同时应注意排除检出病原体定植的情况(B，Ⅱ)。
推荐意见20：对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结果(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测(B，Ⅱ)。
05
二代测序在临床感染性疾病中针对不同病原体类型的诊断效能
推荐意见21：在中枢神经系统感染中，目前证据提示二代测序检测细菌、寄生虫、病毒的效果较好，而中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床试验来检验其检测效能(B，Ⅱ)。
由于二代测序在中枢神经系统感染中的应用仍以病例报道为主，所以可参考的大型研究较少。脑脊液通常含有较低的病原体量，故病原体检测更具挑战性。在5项关于脑脊液的二代测序研究中，诊断率分别为0(0/36)、1.6%(2/)、6%(4/62)、19%(3/16)和30%(3/10)，在无细胞的脑脊液上清液中只能检测到无细胞病毒或无细胞微生物核酸，会导致较低的检出率，提示临床应采用脑脊液而非上清液作为二代测序标本。
国外一项研究显示，与传统临床实验室检查结果比较，二代测序的灵敏度为73%，特异度为99%，阳性预测值为81%，阴性预测值为99%。另一项前瞻性研究对脑膜炎、脑炎和(或)脊髓炎患儿中收集到的20份脑脊液阳性样本进行二代测序检测，与传统的脑脊液微生物检测相比，二代测序检测诊断致病病原体的灵敏度为92%，特异度为96%。我国患儿的脑脊液测序数据显示，55.56%的二代测序检测结果与临床传统方法学一致，其中主要的病原体为细菌。另一项研究发现在疑似中枢神经系统感染的初治患者中，与培养相比，二代测序具有90%的灵敏度，其检出率较培养提高了约25%。
推荐意见22：对于脓毒症患者，推荐联合采用传统实验室培养和二代测序来提高病原学的检出率(B，Ⅱ)。
血流感染的异质性较大，目前尚缺乏针对血流感染者的大型二代测序诊断效能研究。现有的研究结果提示，血液样本二代测序与血培养保持了高度的一致性，是可靠的病原学检测方法。一项中国的研究显示，以培养为金标准，二代测序的灵敏度和特异度分别为72.7%和89.6%；此外，二代测序还表现出了比血培养更高的额外检测效能，成为血培养的有力补充。若以培养联合二代测序、桑格法测序验证作为金标准，则二代测序的阳性率较单用血培养有显著提升(23.08%比12.82%)。另一项关于脓毒症休克的研究中，二代测序的阳性率在起病前3周内波动于71%左右，而血培养阳性率仅在起病时达33%，此后波动于10%~20%。
推荐意见23：对于局灶脓肿或组织感染患者，二代测序的总体灵敏性和特异性均较好，其中对细菌检测的灵敏性优于真菌(A，Ⅱ)。
在关于局灶性感染的病原体检测报道中，个案报道较多。但已有研究证实，二代测序在包括局灶脓液、感染部位组织、感染性的体液标本中的灵敏性均优于传统实验室检测。在骨关节感染中，二代测序与临床培养阳性标本的一致率可达83%～94.8%，在培养阴性的标本中可额外检出49.3%～93%的病原体。肺组织二代测序对细菌感染的灵敏度可达%，特异度为76.5%；对真菌感染的灵敏度为57.1%，特异度为61.5%；对细菌和真菌的阳性预测值分别为42.9%和44.4%，阴性预测值分别为%和72.70%。
推荐意见24：对于呼吸道感染，二代测序在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析(A，Ⅱ)。
推荐意见25：对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低，应对上述菌群设置特定的序列数阈值(A，Ⅲ)。
目前已发表的关于二代测序应用于临床标本的检测效能研究发现，当样本中病原微生物含量较高时，二代测序的总体检测效能与PCR差距不大；但当病毒载量较低时，当前二代测序(20M左右特异性序列数)会出现假阴性，在灵敏度方面不如PCR，需要通过进一步增加数据量来提高检测灵敏度。
二代测序可对不明、少见、不典型病原体进行检测。一项中国的研究对例患者(其中呼吸道感染例)的各种标本行二代测序检测(其中肺泡灌洗液+痰标本共份)；结果提示与培养相比，二代测序对结核分枝杆菌、厌氧菌、真菌的检出率均显著高于培养；以临床诊断为金标准，二代测序比培养显著提高了灵敏度(50.7%比35.2%)，而特异度无显著区别。另一项研究对13例诊断为社区获得性肺炎的免疫抑制患者进行二代测序检测，结果二代测序和培养都检测到5株阳性细菌；但是在真菌检测方面，二代测序对肺孢子菌的灵敏度明显高于培养。
综上，在呼吸道有菌环境下的二代测序结果的判读尚无统一标准。关于二代测序应用于细菌、真菌检验效能的研究尚不多。目前的数据提示与培养相比，二代测序能显著提高灵敏度。但对于结核分枝杆菌等病原体，与临床诊断相比，二代测序的诊断还需更多探索。
推荐意见26：对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率，可作为上述疾病的一线检测手段(A，Ⅲ)。
虽然二代测序检测成本高，但其在免疫缺陷患者和重症患者的病原学诊断中体现出较高的临床应用价值。在使用糖皮质激素合并感染的人群中，二代测序指导下的抗感染治疗方案的成功率为81.8%，显著高于经验性抗感染治疗的52.6%。
对于新发、罕见或疑难感染性疾病，更具有传统培养及其他靶标分子诊断技术所不具备的优势。如年报道的首例杂色松鼠1博尔纳病毒(VSBV-1)所致的脑炎病例和年报道的首例人感染猪疱疹病毒眼内炎病例。
06
二代测序在成本经济效益分析下的临床应用推荐
推荐意见27：目前，开展二代测序的成本仍较高，尚不能作为轻症感染性疾病的一线检测手段(A，Ⅲ)。
高成本仍是制约二代测序在国内广泛开展的主要因素之一。
随着技术的进一步成熟，未来二代测序病原体检测应进一步在成本下降、诊断标准完善、质量控制提升等方面进行完善。同时应进一步增加大样本量的研究，以建立中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范。
END
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